Rola mikroflory jelitowej i bakterii probiotycznych w profilaktyce i rozwoju raka jelita grubego, ARTYKUŁY ...
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; 67: 837-847e-ISSN 1732-2693www.phmd.plReviewReceived:2012.03.16Accepted:2013.01.28Published:2013.08.09Rola mikroflory jelitowej i bakterii probiotycznychw profilaktyce i rozwoju raka jelita grubego*The role of intestinal microflora and probiotic bacteria inprophylactic and development of colorectal cancerEwa Wasilewska1, Dagmara Złotkowska1, Mariola E. Pijagin212Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w OlsztynieDepartment of Pathology, Forde Central Hospital, 6807 Forde, NorwayStreszczenieMikroflora jelitowa to zespół mikroorganizmów, tworzących złożony ekosystem, któregoaktywność wywiera istotny wpływ na zdrowie gospodarza. Oddziałuje ona na organizm napoziomie lokalnym i systemowym. Z punktu widzenia gospodarza może to być oddziaływaniekorzystne lub szkodliwe, obejmujące: stan odżywienia organizmu, infekcje, metabolizm kseno-biotyków, toksyczność spożytych chemikaliów czy procesy nowotworowe. W pracy przeana-lizowano rolę mikroflory jelitowej i probiotyków w rozwoju raka jelita grubego. Szczegółowodyskutowane jest ochronne działanie probiotyków w patogenezie raka okrężnicy. Z badańeksperymentalnych wynika, że korzystna mikroflora jelitowa i jej aktywność metabolicznawywiera istotny redukujący wpływ na zmiany nowotworowe w jelicie. Większość danych po-chodzi jednak z badań na zwierzętach. Opublikowano kilkanaście dobrze udokumentowanychprac badawczych, w których wykazano istotny hamujący wpływ szczepów bakterii fermentacjimlekowej i bifidobakterii na wczesne zmiany neoplastyczne i dalszy rozwój raka w jeliciegrubym małych zwierząt. Badania dotyczące wpływu probiotyków na etiologię i wzrost rakaw przewodzie pokarmowym człowieka są nieliczne. Niemniej, niektóre dane epidemiologicznei kliniczne badania eksperymentalne, głównie z udziałem zdrowych ochotników, wskazująna istotną aktywność przeciwnowotworową probiotyków również w ludzkim przewodziepokarmowym. Mechanizm przeciwnowotworowej aktywności probiotyków nie został po-znany. Zakłada się, że probiotyki zwiększają pulę korzystnej mikroflory jelitowej i hamująrozwój patogenów, przez co zmieniają aktywność metaboliczną, enzymatyczną, warunkifizykochemiczne, redukują stany zapalne i wzmacniają aktywność immunologiczną w jelicie,co ogranicza procesy kancerogenne.Słowa kluczowe:probiotyki • bakterie fermentacji mlekowej • mikroflora jelitowa • rak jelita grubego • mechanizmSummaryThe gut microbiota comprises a large and diverse range of microorganisms whose activitieshave a significant impact on health. It interacts with its host at both the local and systemiclevel, resulting in a broad range of beneficial or detrimental outcomes for nutrition, infections,xenobiotic metabolism, and cancer. The current paper reviews research on the role of intestinalmicroflora in colorectal cancer development. Especially a protective effect of beneficial bacte-ria and probiotics on the risk of cancer development is highly discussed. There is substantialexperimental evidence that the beneficial gut bacteria and their metabolism have the potentialto inhibit the development and progression of neoplasia in the large intestine. Most of the*Artykuł finansowany z grantu badawczego nr 2011/01/B/NZ9/07136 Narodowego Centrum Nauki.Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; 67837Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 837-847data derive, however, from experimental and animal trials. Over a dozen well-documentedanimal studies have been published, wherein it has been clearly revealed that some lacticacid bacteria, especially lactobacilli and bifidobacteria, inhibit initiation and progression ofcolorectal cancer. Studies on cancer suppression in humans as a result of the consumptionof probiotics are still sparse. Nevertheless, some epidemiological and interventional studiesseem to confirm the bacterial anticancerogenic activity also in human gut. The mechanism bywhich probiotics may inhibit cancer development is unknown. Probiotics increase the amo-unt of beneficial bacteria and decrease the pathogen level in the gut, consequently alteringmetabolic, enzymatic and carcinogenic activity in the intestine, decreasing inflammation andenhancing immune function, which may contribute to cancer defense.Keywords:probiotics • lactic acid bacteria • intestinal microflora • colorectal cancer • mechanism33111–68dr Ewa Wasilewska, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk,ul. Tuwima 10, 10-748 Olsztyn; e-mail: e.wasilewska@pan.olsztyn.plFull-text PDF:Word count:Tables:Figures:References:Adres autorki:WstępRak jelita grubego zajmuje drugie miejsce w statysty-kach zachorowań na nowotwory złośliwe w krajachwysoko rozwiniętych i w Polsce. W 2007 r. w skali świa-towej zanotowano ponad 12 mln nowych przypadkówzachorowań na raka i prawie 8 mln zgonów. Szacuje się,że w 2030 r. liczba odnotowanych rocznych zachorowańwzrośnie do 26 mln, a przypadków śmiertelnych do 17mln, co ciekawe najwięcej w krajach średnio i słabo roz-winiętych [65].Według aktualnej wiedzy rozwój choroby nowotworo-wej jest uwarunkowany predyspozycjami genetycznymii warunkami środowiskowymi. Mechanizmy powsta-wania i zapobiegania nowotworzeniu są właściwie nie-znane i są przedmiotem ciągłych badań. Wiele z nichmoże być powiązanych z aktywnością metabolicznąmikroflory przewodu pokarmowego.Przewód pokarmowy dorosłego człowieka to złożonyekosystem, zawierający ponad 1012mikroorganizmóww 1 g treści, które należą do około 1000 różnych gatun-ków drobnoustrojów. Kolonizujące jelito, głównieokrężnicę, populacje bakteryjne mają ogromny poten-cjał metaboliczny i enzymatyczny – współuczestnicząw metabolizmie wielu egzo- i endogennych związków,tworząc produkty, które mogą wykazywać aktywnośćfarmakologiczną lub toksykologiczną. Mimo że dookrężnicy dociera tylko niewielka grupa niestrawio-nych wcześniej składników pożywienia, wiele substancjipochodzących z żywności i ich metabolitów dostaje siętu z krwi, przez ścianę jelita lub z wydzielaną do prze-wodu jelitowego żółcią i może ulegać dalszym przemia-nom w wyniku aktywności metabolicznej obecnychw okrężnicy bakterii. W konsekwencji powstaje wielezwiązków, które wpływają na fizjologię gospodarza,oddziaływając nań szkodliwie lub korzystnie.prokancerogenna aktyWność mikroflory jelitoWejW wyniku negatywnych przemian metabolicznychindukowanych przez drobnoustroje jelitowe mogąpowstawać substancje toksyczne, mutagenne i kancero-genne, które zatruwają organizm bądź przyczyniają siędo rozwoju chorób nowotworowych.Reddy i wsp. jako jedni z pierwszych wykazali, żeu szczurów gnotobiotycznych bez drobnoustrojów(germ-free rats), liczba guzów w okrężnicy, po induk-cji 1,2-dimetylohydrazyną, była znacznie mniejsza niżw grupie kontrolnej z naturalną mikroflorą jelitową [57].Późniejsze badania potwierdziły, że kał ludzki wyka-zuje aktywność mutagenną, między innymi w związkuz obecnością substancji genotoksycznych pochodzeniabakteryjnego. Bakterie mogą wytwarzać ze składnikówpokarmowych substancje genotoksyczne, kancero-genne, promujące rozwój nowotworów bądź mogą akty-wować prokancerogeny do czynników reagującychz DNA. Stwierdzono znacznie niższy poziom adduktówDNA w tkankach szczurów „germ-free” żywionych dietąludzką w porównaniu do tak samo żywionych szczurówkonwencjonalnych hodowanych w warunkach otwar-tych. W badaniach Kado i wsp. na myszach TCR b-/-p53-/– z dużą skłonnością do spontanicznego rozwojuraka okrężnicy (myszy z podwójnym nokautem – łań-838Ewa Wasilewska i wsp. – Rola mikroflory jelitowej...cucha b receptora TCR limfocytów T oraz genup53)aż70% myszy zasiedlanych naturalną mikroflorą jelitowąwykazywało obecność gruczolakoraków w okrężnicy,przy ich całkowitym braku w przypadku myszy jało-wych bez mikroflory [28].Dotychczasowe próby porównania mikroflory kało-wej osób zdrowych i pacjentów z rakiem okrężnicy niewykazały istotnych różnic w składzie mikroflory jeli-towej. U osób z podwyższonym ryzykiem zachorowa-nia stwierdzano jedynie podwyższoną liczbę komórekBacteroides,lecytynazoujemnych szczepówClostridiumorazLactobacillus[31,44]. W innych badaniach stwier-dzono pozytywną korelację między obecnością niektó-rych szczepówLactobacillusi Eubacterium aerofaciensa zmniejszonym ryzykiem wystąpienia nowotworu [44].Do inicjacji procesu nowotworowego dochodzi na wielelat przed jego zdiagnozowaniem, natomiast przewódpokarmowy i kolonizująca go mikroflora jelitowa to bar-dzo dynamiczny ekosystem, którego skład i aktywnośćmetaboliczna zmienia się pod wpływem zmian środowi-skowych, tj. pH czy różnice w zawartości tlenu i skład-ników pokarmowych. Dlatego trudno znaleźć korelacjęmiędzy chorobą a inicjującą ją mikroflorą.Stosunkowo dobrze udokumentowano związek powsta-wania raka okrężnicy z obecnością szczepówStrepto-coccus bovis,gatunku często kojarzonego z bakteriemiąi zapaleniem wsierdzia. Już w latach 80 i 90 ub.w. bada-nia wykazały, że 25-80% pacjentów z bakteriemiąS. bovismiała nowotwory okrężnicy [63]. Klein i wsp. jako jedniz pierwszych stwierdzili podwyższoną liczbę komórekS. bovisw kale pacjentów ze zdiagnozowanym rakiemokrężnicy [32]. Późniejsze badaniain vitroi in vivonaszczurach traktowanych azoksymetanem (AOM) wyka-zały związek między prozapalną aktywnością białekściany komórkowejS. bovis,a aktywnością kancerogennątych bakterii [5].żenia zakażeniem w miejscu bytowania oraz zdolnośćodtwarzania się po zaburzeniu składu, np. w wynikuterapii antybiotykowej. Stabilność mikroflory jelitowejjest prawdopodobnie wynikiem rozpoznania bakteriinabytych we wczesnym dzieciństwie i wytworzenia nanie tolerancji przez układ odpornościowy jelit, którypo fragmentacji i ekspozycji antygenów bakteryjnychidentyfikuje je jako własne. Fizjologiczna flora jelitowajest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania układupokarmowego, układu odpornościowego oraz prawidło-wego trawienia pożywienia. Jej podstawowym zadaniemjest zapobieganie infekcjom i nadmiernemu namna-żaniu mikroflory oportunistycznej. Bakterie jelitowewpływają na wzrost, różnicowanie i wymianę entero-cytów w jelicie, mają właściwości immunomodulacyjne,wpływają na czynności motoryczne przewodu pokar-mowego, rozkładają obecne w pożywieniu toksynyi kancerogeny, syntetyzują substancje śladowe, fermen-tują nietrawione przez organizm składniki pożywieniaoraz współuczestniczą w procesie wchłaniania elektro-litów i soli mineralnych [51].Istnieje ścisły związek między mikroflorą jelitową, jejaktywnością metaboliczną a sposobem żywienia i zdro-wiem gospodarza. Nasilające się złe nawyki żywieniowe,stres, antybiotykoterapia, niekorzystne czynniki środo-wiskowe i predyspozycje genetyczne przyczyniają się dozaburzeń składu i funkcji mikroflory przewodu pokar-mowego i inicjacji procesów chorobowych. Dlatego,dużym zainteresowaniem dietetyków i lekarzy cieszą sięprobiotyki, zgodnie z definicją FAO/WHO żywe mikroor-ganizmy, które podawane we właściwej ilości korzystniewpływają na organizm gospodarza. Od lat są z powodze-niem stosowane w profilaktyce i terapii niektórych cho-rób zakaźnych [21]. Podawanie probiotyków zwiększapulę korzystnej mikroflory jelitowej, przez to wydaje sięstwarzać również warunki do ograniczania zmian nowo-tworowych w jelicie.korzystna rola mikroflory jelitoWejNiekorzystnym zmianom w jelicie wytwarzanym przezmikroflorę oportunistyczną i patogeny przewodupokarmowego, przeciwdziała tzw. korzystna mikroflorajelitowa. Wiedza na temat jej składu i funkcji jest wciążograniczona. Kolonizacja jelita rozpoczyna się bezpo-średnio po urodzeniu i trwa przez wiele lat, a jej osta-teczny, charakterystyczny dla osobnika skład różnychpozostających we wzajemnej równowadze populacjibakterii, w których na ogół przeważają gatunki z rodzajuBacteroides, Eubacterium, Peptostreptococcus, Bifidobacte-rium, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Staphylococ-cusoraz pałeczki z rodzinyEnterobacteriaceae,zależy odwielu egzo- i endogennych czynników.Ustabilizowana mikroflora jelitowa często określana jestmianem fizjologicznej mikroflory jelitowej, ponieważzapewnia prawidłowe funkcjonowanie organizmu. Jejcechy charakterystyczne to zdolność zasiedlania błonśluzowych, adaptacja do zasiedlanych krypt bez zagro-antykancerogenna aktyWność probiotykóWZ końcem lat siedemdziesiątych ub.w. Goldin i wsp.wykazali, że spożywanie mleka fermentowanego zawie-rającego pałeczkiLactobacillus acidophiluszwiększa ichliczbę w jelicie szczurów, a przez to redukuje poziomwytwarzanej przez bakterie jelitowe b-glukuronidazy,azoreduktazy i nitroreduktazy oraz liczbę bakterii gnil-nych, takich jak pałeczki z grupy coli, przypuszczalniebiorące udział w wytwarzaniu promotorów raka i pro-kancerogenów [20]. Zapoczątkowało to okres inten-sywnych badań nad antykancerogenną aktywnościąbakterii fermentacji mlekowej i probiotyków w jelicie.Najlepiej udokumentowana wiedza na ten temat pocho-dzi z badań na zwierzętach.Badania na zwierzętach.Opracowano kilka modelizwierzęcych, które okazały się użyteczne do identy-fikacji czynników żywieniowych chroniących przedrozwojem raka jelita grubego [33]. W badaniach probio-tyków powszechne uznanie znalazły modele chemicz-839Postepy Hig Med Dosw (online), 2013; tom 67: 837-847nej indukcji nowotworu u małych gryzoni, w którychzależnie od czasu trwania doświadczenia, monitoro-wane są ogniska ACF (aberrant crypt foci), czyli zmie-nione patologicznie krypty jelitowe, uważane zazmiany, które mogą być prekursorami zmian prowa-dzących do rozwoju gruczolaków i/lub raka jelita gru-bego oraz guzy rakowe CRC (colorectal cancer) [21].Capurso i wsp. zanalizowali wyniki prac badawczychdotyczących wpływu probiotyków (w tym prepara-tów probiotycznych, bakterii fermentacji mlekowejlub mlecznych napojów fermentowanych) na zmianyneoplastyczne i rozwój raka jelita grubego opubliko-wane w bazie Medline w latach 1980-2006 [10]. Analiząobjęto prace, w których monitorowano ogniska ACF lubguzy CRC. Zaktualizowane wyniki analizy poszerzoneo prace opublikowane do lutego 2012 r. przedstawionow tabeli 1. We wszystkich doświadczeniach, z wyjąt-kiem badań przeprowadzonych na myszach z nokautemgenu IL-10 lub genu APC, zmiany przedrakowe i rakowebyły indukowane kancerogenami. Badania wykazałyistotny hamujący wpływ probiotyków na oba analizo-wane parametry. Łącznie przebadano 54 warianty pre-paratów probiotycznych, w tym w kierunku zmian ACF33, a w kierunku zmian CRC 26 preparatów (tabela 1).Dwadzieścia dwa preparaty (z 33 badanych) redukowałyzmiany ACF w jelicie, a 16 (z 26 badanych) zmiany CRC.Jedynie Caderni i wsp. wykazali wzrost ilości ACF po 16tygodniach podawania szczurom synbiotyku ze szcze-pamiLactobacillusGG,L. delbrueckiisubsp.rhamnosusi B. lactis Bb12, chociaż w tym samym doświadczeniu po32 tygodniach autorzy stwierdzili spadek przypadkówCRC [9]. W kilku innych doświadczeniach, w którychwykorzystano kultury jogurtowe (szczepS. thermophilusi L.bulgaricus), B. adolescentis, L. casei, B. longum, L. lactislubE. faeciumw połączeniu z L. helveticus spp.jugurtiniestwierdzono wpływu badanych preparatów na wystę-powanie ACF lub CRC [3,7,38,39,60,61]. Niektóre szczepybyły skuteczne tylko w preparatach probiotycznycho zdefiniowanym składzie w połączeniu z prebiotykiem– w postaci synbiotyku [15,16,37]. Również inne bada-nia, przeprowadzone w mniej popularnych układachmodelowych, wykazały ochronne działanie probioty-ków w rozwoju raka jelita grubego. Appleyard i wsp.stwierdzili ochronny wpływ probiotyku VSL#3 na roz-wój CRC w układzie modelowym chronicznego zapale-nia okrężnicy [2]. Z kolei Chen i wsp. wykazali redukcjęwzrostu komórek rakowych po implantacji raka domyszy preinkubowanychLactobacillus acidophilusNCFM[12]. Cytowane wyniki badań wskazują na zróżnico-waną, ale istotną aktywność probiotyków w ogranicza-niu zmian nowotworowych w jelicie.Badania z udziałem ludzi.Mimo obiecujących wyni-ków na zwierzętach, brakuje badań skierowanych naocenę skuteczności probiotyków w hamowaniu kance-rogenezy w jelicie grubym człowieka. Dotychczasowebadania epidemiologiczne dotyczące roli diety w kance-rogenezie jelitowej są bardzo niejednorodne, jeżeli cho-dzi o sposób ich przeprowadzenia, badane populacje,terminologię, definiowanie analizowanych czynnikówczy ocenę stanu chorobowego. Nie były ukierunkowanebezpośrednio na analizę wpływu probiotyków na rozwójchoroby, stąd opublikowane dane są niespójne i trudnedo porównania. Niektóre wskazują jednak na antykan-cerogenną aktywność w jelicie mlecznych napojówfermentowanych – produktów zawierających w swymskładzie bakterie fermentacji mlekowej.Stosunkowo dobrze udokumentowane przeprowadzonew latach 1985-1990 w USA (1482 przypadki) i we Fran-cji (1268 przypadków) badania porównawcze pacjen-tów z rakiem okrężnicy i odpowiadających im podwzględem wieku, płci i środowiska bytowania osóbzdrowych wykazały odwrotną korelację między czę-stością występowania raka okrężnicy a spożywaniemjogurtu, przy braku wpływu innych produktów mlecz-nych [8,63]. Spożywanie jogurtu obniżało statystycznieśmiertelność z powodu raka jelita grubego w badaniachkohortowych przeprowadzonych w latach 1988-1990w Japonii (ok. 108000 osób) [34]. Niestety inne, równiedobrze udokumentowane badania, przeprowadzonew latach 1980-1988, 1986-1990 i 1967-1991, odpowiedniow USA (ponad 18000 osób), w Holandii (~121000 osób)i w Szwecji (~10000 osób) wskazują na brak zależnościmiędzy procesem nowotworzenia a spożywaniem pro-duktów mlecznych, w tym produktów fermentowanych[29,31,32]. Mimo to, ostatnie zakrojone na równie sze-roką skalę prospektywne badania kohortowe w Szwe-cji (7 lat, około 46000 osób) i we Włoszech (12 lat, ok.46000 osób), wyraźnie wskazują na odwrotną zależnośćmiędzy zachorowalnością na raka jelita grubego a spo-żywaniem wapnia i produktów mlecznych, w tym fer-mentowanych [36,52].Brakuje klinicznych badań eksperymentalnych z udzia-łem probiotyków. Ishikawa i wsp. badali wpływ probio-tyków (szczepL. caseio udokumentowanej aktywnościantymutagennej) i błonnika (otręby pszenne) na roz-wój raka jelita grubego u pacjentów po usunięciu conajmniej 2 gruczolaków lub wczesnego raka jelita gru-bego. Badaniem objęto 398 pacjentów [26]. Po czterechlatach trwania doświadczenia częstość występowa-nia gruczolaków o umiarkowanej lub dużej atypii byłaistotnie niższa w grupie żywionej szczepemL. casei.Jed-nak nie stwierdzono wpływu szczepu na rozwój zmianneoplastycznych u pacjentów otrzymujących jedno-cześnie błonnik pokarmowy. Dwa lata później Rafteri wsp. opublikowali wyniki badań randomizowanych,z podwójną próbą ślepą i kontrolą placebo, przeprowa-dzonych w ramach programu SYNCAN (finansowanegoprzez Unię Europejską) [55]. Autorzy przez 12 tygodnipodawali pacjentom po wycięciu gruczolaka lub rakaokrężnicy synbiotyk zawierający prepiotyk BeneoSy-nergy 1 (ORAFTI, Belgia) oraz probiotyczne szczepyBifidobacterium lactisBb12 i Lactobacillus delbrueckiisubsp.rhamnosusGG. Komórki nabłonka pacjentówżywionych synbiotykiem były mniej podatne na dzia-łanie czynników cytotoksycznych i genotoksycznychw jelicie. Żywienie interwencyjne synbiotykiem zwięk-szało pulę korzystnej mikroflory jelitowej, tj. Bifidobac-840Ewa Wasilewska i wsp. – Rola mikroflory jelitowej...Tabela 1. Zestawienie najważniejszych wyników badań przeprowadzonych na zwierzętach w latach 1977-2011Czynnik probiotycznySposób podawaniaL. acidophilusMleko fermentowane przezS. thermophiluslubL. bulgaricusB. longumBB-536B. longumBifidobacterium sp Biolub mleko fermentowaneprzezBifidobacterium sp BioL.caseisubsp.rhamnosusGGBifidobakterie,L. acidophilusi FOS w mleku oddzielnielub w połączeniu każdy z każdymWb1211216KancerogenaModelzwierzęcyasamceszczurów F344szczury F344samce i samiceszczurów F344samceszczurów F344samceszczurów F344samceszczurów F344samceszczurów SprDszczurygnotobiotyczneF344zasiedlanemikroflorąjelitowąsamceszczurów F344samceszczurów F344samceszczurów SprDsamceszczurów SprDsamceszczurów F344samceszczurów SprDsamceszczurów SprDsamceszczurów SprDmyszyz nokautemgenu IL-10myszy CH3/HenBadaneparametryaCRCCRCCRCACFACFCRCACFWpływ naanalizowanyparametr¯ CRC po 20 tyg.,brak różnic po36 tyg.CRC - brak wpływu¯ CRC¯ ACF¯ ACF¯ CRC¯ ACF (tylkobifidobakteriew połączeniu FOS)LiteraturaDMHDMHIQAOMDMHDMHDMH1859563311916B. breve1DMHACF¯ ACF47B. longumoddzielnie lub w połączeniu z laktuloząB. longumL. acidophilusATCC 4356,B. adolescentisATCC 17703,C. perfringensGAI0668 – podawane oddzielnieB. longumpodawany osobno lub w połączeniu z inulinąL. acidophilusNCFMTMBifidobakterie podawane osobno lub w połączeniuz oligofruktoząL. acidophilusDelvo Pro LA1 podawany osobno (A),L. acidophilusDelvo Pro LA1 podawany w połączeniuz B. animalis CSCC1941 (AB),L. rhamnosusGG osobno (R),orazS. thermophilusDD145 osobno (S)L. caseiShirotaL. salivariusL. caseiShirota213212AOMAOMAOMAOMAOMDMHACFCRCACFACFACFACF¯ ACF (wyższyw połączeniu)¯ CRC¯ ACF tylkoL. acidophilusi C. perfringens¯ ACF (wyższyw połączeniu)¯ AFC¯ ACF (tylkow połączeniu)¯ CRC (tylkow grupie A)¯ ACF, ¯ CRC¯ CRC¯ CRC116135855155DMHCRC42111AOMnie dotyczy3-MCACF, CRCCRCCRC684663841
[ Pobierz całość w formacie PDF ]